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    細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用檢測法

    點(diǎn)擊次數(shù):1125  更新時(shí)間:2015-11-16

    (一)原理

        以NK細(xì)胞為例。將待測者外周血中的NK細(xì)胞與靶細(xì)胞(K562細(xì)胞)按一定比例混合培養(yǎng)一定時(shí)間,NK細(xì)胞作用于靶細(xì)胞,使靶細(xì)胞被殺死、破壞,進(jìn)而使靶細(xì)胞線粒體內(nèi)的乳酸脫氫酶釋放出來.使底物發(fā)生顏色變化,其顏色深淺與酶的釋放量成正比,檢測顯色后的光密度OD值,便可推算出NK細(xì)胞的殺傷活性。

    (二)材料

    1.待檢者肝素抗凝血,靶細(xì)胞為K562細(xì)胞。

    2.RPMI 1640培養(yǎng)液、淋巴細(xì)胞分離液。

    3.酶標(biāo)儀、離心機(jī)。

    (三)方法

    1.用含5%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將靶細(xì)胞調(diào)整到5×104~2×105/ml,此濃度需根據(jù)情況預(yù)先標(biāo)定。

    2.取待檢者肝素抗凝血3~5ml,經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞,為效應(yīng)細(xì)胞。

    3.在96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入靶細(xì)胞,每孔加100μl。3個(gè)效應(yīng)細(xì)胞自然釋放對(duì)照孔不加靶細(xì)胞.只加100μl培養(yǎng)液。

    4.向各孔加:100μl效應(yīng)細(xì)胞,效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例根據(jù)要求而定,通常為5:l~20:1。自然釋放孔不加效應(yīng)細(xì)胞只加100μl培養(yǎng)液,zui大釋放孔中加100μl1%NP40。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

    5.置37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6h。

    6.離心培養(yǎng)板1000r/min離心10min。每孔吸出150μl上清液.對(duì)應(yīng)加入另一塊96孔酶聯(lián)檢測板中。向第二塊板每孔依次加20μl O.4mol/L乳酸溶液、20ml 4mmol/L 2一p一碘苯酯一3一p一氯化硝基苯四唑,20μl反應(yīng)液[含O.03%BSA.2.7U/m1硫辛酰胺脫氫酶.4.5mmol/L氫化型輔酶I(NAD+ ),1.2%蔗糖的PBS],室溫中放置20min。

    7.在酶聯(lián)檢測儀上測定各孔的光密度(OD值),檢測波長492nm,參考波長650nm;

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